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WB实验常见问题分析

WB实验常见问题分析

1.     无信号或信号弱

问题

可能原因

建议解决办方案

无目的条带

检测样本不表达目的蛋白或目的蛋白表达量过低

设置阳性对照,确定检测样本是否为阴性

增加上样量

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

抗体失活

选择在有效期内的抗体

选择现配现用的工作液

试剂不匹配

一抗和样本种属不匹配:购买抗体前确定抗体是否能够识别检测种属的对应蛋白

一抗与二抗不匹配:选择针对一抗种属来源的二抗

底物与酶系统不匹配:选择与酶系统匹配的底物

通过设置内参对照可以验证二级检测系统的有效性

底物失活

选择在有效期内的底物

目的蛋白未转移到膜上

确保按照膜制造商的使用说明浸透膜

确保足够的转膜时间:对于厚胶及高分子量蛋白需要延长转膜时间

有目的条带,但条带比较弱

检测样本目的蛋白表达量过低

设置阳性对照,确定检测样本是否为阴性

增加上样量

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

蛋白转移不充分

确保按照膜的制造商的使用说明浸透膜

确保足够的转膜时间:对于厚胶及高分子量蛋白需要延长转移时间

蛋白转移过度

目的蛋白分子量过低可能会穿过转印膜,需选择小孔径的膜,缩短转膜时间

抗体失活

选择在有效期内的抗体

工作液现配现用,避免长时间放置

洗膜过度

缩短洗膜时间

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间

更换封闭剂类型

曝光时间过短

延长曝光时间

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

2.     非特异性条带(有杂带)

问题

可能原因

建议解决办法

 

 

 

非特异性条带(杂带多)

抗体浓度过高

降低抗体(一抗、二抗)浓度

蛋白上样量过高

适当降低上样量

目的蛋白降解

使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂

样本处理在冰上操作

一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体

目的蛋白有其他剪切体形式存在

有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式,每个剪切方式的得到的蛋白大小都不相同

建议查阅文献或生物信息学分析可能性

细胞传代过多,导致蛋白变异

使用原代或传代少的细胞做对照

二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度

3.     背景相关问题

问题

可能原因

建议解决办法

背景高

抗体浓度过高

降低抗体浓度

封闭不充分

延长封闭时间或提高封闭温度

选择更加合适的封闭液

抗体与封闭液中其它蛋白发生交叉反应

检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂

洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应

一抗孵育温度偏高

4℃孵育过夜

曝光过度

缩短曝光时间

检测过程中膜干燥

保证充分的反应液,避免出现干膜现象

膜没有完全均匀湿透

确保按照膜制造商的使用说明浸透膜

洗膜不充分

增加洗液体积和洗膜次数

背景不均匀

转膜过程中有气泡存在

仔细检测,避免存在气泡

抗体分布不均匀

孵育抗体时使用摇床

背景有黑色斑点

HRP耦联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂,去除聚集体

封闭剂中有聚集体

封闭试剂使用前过滤

抗体与封闭试剂反应

封闭试剂使用前过滤

 

 

 

4.     其他问题

问题

可能原因

建议解决办法

膜上出现反像(暗背景上白色带)

HRP含量过高

降低酶联二抗的浓度

目的蛋白含量过高

适当减少上样量

抗体浓度过高

稀释抗体,降低抗体浓度

条带位置(大小)不对

蛋白修饰

糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加

翻译后修饰

一些蛋白以前体蛋白的形式合成,在执行功能时需要剪切成活化的形式

胶浓度不合适

高分子量蛋白要用低浓度胶;小分子量蛋白要用高浓度胶

蛋白样本降解

使用新鲜配置的样本

出现重影

压片时X光片出现位移

X光片放好后勿再动

微笑状条带

电泳速度过快

减慢电泳速度

电泳系统温度过高

在冷室或者冰浴中进行电泳,改变电泳pH

皱眉状条带

凝胶和玻璃挡板底部有气泡

调整装置

条带向两边扩散

加样量过多

适当减少上样量

Maker变黑色

抗体和Maker蛋白反应

MakerSample之间空出一个孔

条带中出现边缘规则的白圈

电转中膜和胶之间存在气泡

转膜前保证去除膜和胶之间的气泡

条带呈哑铃状

配胶有问题

重新配胶

样本杂质太多

上样前充分离心样本

条带拖尾

蛋白上样量高

适当降低上样量

抗体染色过度

降低抗体浓度,缩短抗体孵育时间

最边缘条带弯曲

电泳电流不均一

不使用两边的两孔

 

温馨提示:

O  产品使用前请先离心

O  确保-20℃保存,避免长时间室温放置,尽量冰上操作;

O  请在有效期内使用产品;

O  首次使用产品时请设置浓度梯度,选择最佳浓度进行实验;

O  购买产品前,请先认真阅读产品说明书,选择与实验匹配的产品;

O  实验尽量设置阳性对照,便于结果分析。

O  化学发光液现用现配。