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如何选择流式抗体

如何选择流式抗体,必赢建议您从以下六个方面进行考虑:

1. 满足抗体选择的基本条件
靶蛋白特异性:确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记,清楚您要检测什么。
种属:严格按照待测样本种属选择抗体来源,流式抗体基本无种属间交叉反应。
应用领域:可用于流式实验,说明书中明确标注经FC实验测试,最好有实验数据图和用量说明。
抗体克隆号:一般选择参考文献上提到的克隆;同一抗体多个克隆号的情况下,可以选择荧光标记种类最多的那个克隆。

2. 确定流式细胞仪的参数配置

在设计流式检测方案前,根据可能需要同时检测指标的数量,先确定流式细胞仪的型号,对该仪器的参数配置,要了解以下几个方面的信息:
激光器:常见的流式细胞仪有488 nm和633 nm两个激光器,但有些机器在购买时因某些原因,只装了一个488 nm激光器,所以需要注意型号相同的机器也未必激光配置相同。
滤光片:也就是有几个检测通道,这决定了你最多可以同时检测几个指标。
仪器的具体型号:有助于再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测,有时候检测通道也是不一样的。

3. 荧光的选择建议
直标还是间标:待测抗原表达丰度高的尽量选择直标抗体,待测抗原表达丰度低的需要考虑选生物素标记抗体。
荧光强弱: 荧光本身有强弱之分,可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。如抗原表达丰度弱或分群不明显的建议选择强荧光,例如:PE、APC;反之,抗原表达丰度强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光,例如FITC即可(常用荧光强弱程度排序为:PE>APC>PE/Cy5>PerCP/Cy5.5>FITC)。
类似荧光的权衡:可以尝试选择新型荧光Alexa Fluor、eFluor等。因为这些荧光非常明亮,对激光稳定性好,对PH 值不敏感,具有水溶性(如Alexa Fluor488与FITC检测通道相同,但是荧光强度和光敏感上,前者明显优于后者)。

4. 多色荧光搭配的原则
多色分析方案中荧光抗体的选择和搭配,会受到很多因素的制约,是个难点。
检测通道不能冲突:每个检测通道只能选择1种荧光素,各通道之间的荧光素可以随意搭配(如FL1选择了FITC标记的抗体,就不能再选择Alexa Fluor488标记的抗体;而同组实验的其余抗体选择PE或者APC标记,都可以随意组合)。
荧光强弱:所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少,否则将会导致较大的补偿。例如,PE/Cy5与APC同时标记,将会导致补偿过度,需换成PE/Cy5.5或PerCP/Cy5.5。最常用的荧光搭配是:FITC、PE、PerCP、PerCP/Cy5.5、APC。
多色荧光搭配:多色分析往往会因个别抗体荧光素种类极少而受到限制,需要同时参考多家抗体必赢的产品进行方案设计。因此如遇5色以上分析需求,建议咨询必赢技术支持。

5. 抗体使用剂量
同一个产品通常会提供多个规格供您选购,可以根据实验的具体样本量和说明书建议用量来确定抗体用量:
细胞数:通常情况下流式检测一次的样本量为10^6~10^8个细胞,建议对样本做细胞计数,以保证抗体标记效果最佳;
包装:以test为计量单位的抗体,按照每test细胞悬液体积计算出每次加入多少体积抗体即可; 以ug为计量单位的抗体,需要根据说明书计算出每次加入多少体积的抗体。

6. 同型对照抗体的选择
同型对照(Isotype Control),是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色,是真正意义上的流式阴性对照,流式细胞实验不可或缺的一项。
来源:同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白,也要求使用相同剂量。同型对照一定要选择准确,通常在荧光一抗的说明书中,厂家会给出同型对照抗体的货号;
纯化级别抗体:如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗,那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体(如样品管为:纯化的CD3+PE标记的二抗+样本;则对照管为:纯化的同型对照+ PE标记的二抗+样本)。
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下一章:Annexin V测细胞凋亡发布时间: 2015-12-16