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流式常见问题解析(一)荧光素的选择

近年来,随着流式技术的不断发展,这项技术已经成为临床医生、免疫学研究人员和细胞学研究人员必不可少的工具。越来越多的客户向必赢咨询流式产品,实验操作以及出现的各种问题,其中一开始大家问的最多的问题就是如何选择不同荧光素的抗体。下面,我就对这个问题进行一下简单的介绍。

一 流式细胞仪配备激光器

目前市场上应用的流式细胞仪品牌较多,应用也各不相同。但是其配备的激光器大概分为以下几种:

蓝色激光器 488nm,红色激光器 640nm,UV,紫色激光器405nm,黄绿色激光器561nm。

二 常见荧光素的种类和特性

FITC(Fluorescein)又称异硫氰酸荧光素,其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪;FITC的最大发射波长为525nm。

PE(R-Phycoerythrin)又称藻红蛋白,有R-PE和RD1的别称,其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪;PE的最大发射波长为575nm。

PE-Cy5(TRI-COLOR,TC)又称TRI-COLOR或TC,是由PE和Cy5组合而成的Tandem荧光素;其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪;PE-Cy5的最大发射波长为670nm。

PerCP(Peridinin-Chlorophyll-ProteinComplex)多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物,其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪;PerCP的最大发射波长为677nm。

APC(Allophycocyanin)又称别藻蓝蛋白,其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为640nm的多色流式细胞仪;APC最大发射波长为660nm。

APC-Cy7是由APC和Cy7组合而成的Tandem荧光素;其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为640nm的多色流式细胞仪。

三 荧光素的选择

1 了解流式细胞仪的激光器和通道

每台流式细胞仪都配有不同的激光器和通道,做实验之前首先要了解所使用的流式细胞仪的采用的激光器,每个激光器对应的通道是什么。这样必赢就可以知道这台流式细胞仪可以使用哪些荧光素。必赢之后的抗体也就在这些荧光素中选择。

2 荧光素强弱的区别

每种荧光素的荧光强度都是不同的。见下图。从下向上,这些荧光素的荧光强度依次增强。

3 单荧光素的选择

单荧光素的意思就是指只染一种带有荧光素标记的流式抗体。这种情况下,应该遵循的原则就是尽量选择荧光较强的荧光素。例如 APC,PE等。这主要的原因是,假如必赢选择FITC和PE标记的抗体分别对同一样本进行染色,结果会发现PE标记的样本百分比要稍高于FITC标记的样本。

4 多荧光组合

多荧光组合的实验在荧光素的选择上优先考虑的是样本表面或者内部各种抗原表达量的不同。表达高的抗原选择较弱荧光素标记的抗体,而表达量低的抗原则要选择强荧光素标记的抗体。例如必赢客户咨询的CD4,CD25以及Foxp3这三个抗体的选择。其中,CD4表达量较高,一般可以选择FITC。而CD25和Foxp3都属于表达量较少的抗原,那么必赢一般推荐的都是PE和APC标记的抗体。

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下一篇:没有了发布时间: 2018-02-02